آنتي بيوگرام

 

دستورالعمل روش انجام آزمايش  آنتي بيوگرام

هدف :

اطمینان از صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت دارويي باكتريهاي بيماريزاي شناخته شده بر اساس روش انتشار ديسك در آگار Disk Diffusion

دامنه کاربرد

این دستورالعمل جهت انجام صحيح آزمايش آنتي بيوگرام در بخش میکروبیولوژی و آنالیز ادرار آزمایشگاه کاربرد دارد .

تجهيزات و لوازم مورد نياز

محيط كشت مولر هينتون آگار

خط كش

ديسك هاي آنتي بيوگرام

چراغ الكلي

پنس استريل

روش انجام آزمایش

در شرايط استريل توسط سواب پنبه اي مقداري از كشت ميكروبي (كه بايد ميزان كدورت سوسپانسيون باكتري با كدورت نيم مك فارلند مطابقت داشته باشد) را در تمام سطح پليت مغزي تلقيح كنيد.

ديسك هاي آنتي بيوگرام را بوسيله پنس استريل در سطح پليت قرار داده و با كمي فشار آنها را كاملاً بر سطح آگار بچسبانيد.

پليت ها را به صورت وارونه در گرمخانه 37 درجه به مدت 24 ساعت نگهداري كنيد.

پس از طي دوره انكوباسيون، بوسيله خط كش، قطرها در عدم رشد را در اطراف ديسك ها اندازه گيري و ثبت كنيد و با توجه به جدول همراه ديسك ها، گزارش تست آنتي بيوگرام را براي هر

يك از آنتي بيوتيك ها به صورت حساس (Sensitive)، مقاوم (Resistant) يا نيمه حساس (Intermediate) گزارش كنيد.

نكات مهم در انجام تست آنتي بيوگرام

براي تلقيح نمونه، ابتدا با سواب استريل سوسپانسيون ميكروبي را مخلوط كرده، سواب را با قدرت به ديواره لوله تكيه داده و فشار دهيد تا آب اضافي آن گرفته شود، سپس آن را به محيط

مولر هينتون انتقال داده و تماس سطح محيط را به چمني تلقيح كنيد.

ديسك هاي آنتي بيوگرام را نيم ساعت قبل از كاشت در محيط كشت، بيرون از يخچال قرار دهيد.

قبل از استفاده از محيط كشت آنها را از يخچال خارج نموده و به مدت 20 -10 دقيقه در انكوباتور 37 درجه قرار دهيد تا رطوبت موجود در سطح آگار خشك گردد.

ديسك ها را به صورت دايره اي و به فاصله 2/1 سانتي متر از يكديگر بكاريد.

ضخامت محيط كشت مولرهينتون آگار بايد به طور يكنواخت در تماس پليت ها 5 ميليمتر باشد.

بايد توجه داشت كه ديسك هاي مورد استفاده متناسب با نوع باكتري انتخاب شود، براي مثال: هيچگاه براي باكتري گرم منفي ديسكم پني سيلين استفاده نكنيد، زيرا نسبت به آن مقاوم

است و يا براي كشت ادرار از ديسك كلرامفنيكل استفاده نكنيد، براي اينكه اين آنتي بيوتيك نمي تواند وارد مجاري ادراري شود.

هنگام خواندن نتيجه دقت كنيد كه همواره امتداد خط كش از وسط ديسك عبور كند.

هميشه قطر هاله عدم  رشد را اندازه گيري كنيد.

هميشه نگاه بدبينانه داشته و كوتاهترين مسير را براي تعيين حساسيت انتخاب كنيد.

اگر در اطراف ديسك حتي يك كلني هم باشد، بايد از همانجا تا ديسك را اندازه گيري كرده قطرهاله را ….

قطره هاله عدم رشد را در زير نور بررسي و تعيين كنيد.

پس از تلقيح باكتري به محيط آنتي بيوگرام، در فاصله حداكثر 15 دقيقه بايد ديسك ها در سطح آگار كاشته شوند.

در برخي از باكتريهاي سخت رشد براي انجام تست آنتي بيوگرام، از محيط هاي كشت اختصاصي استفاده مي شود.

جهت تلقيح حتماً از ايزوله خالص استفاده شود. اگر نمونه مورد استفاده خالص نباشد، تست كاملاً اشتباه خواهد بود.

تا زماني كه ديسك را روي محيط فشار نداده ايد، مي توانيد جاي آن را تغيير دهيد، اما بعد از فشار دادن ديسك و تثبيت آن، به هيچ عنوان ديسك را جابجا نكنيد.

قبل از كاشت ديسك ها بررسي كنيد كه حاوي مشخصات باشد.

اگر نمونه تلقيح شده پس از انكوباسيون به صورت يك دست رشد نكرده باشد، نشان دهنده اين است كه مقدار كلني برداشت شده كمتر از استاندارد مك فارلند بوده است.

اگر در اطراف تمام ديسك ها هاله تشكيل شود و يا در اطراف هيچ يك از ديسك ها هاله اي تشكيل شود، بايد تست تكرار شود.

اگر PH محيط مولرهينتون آگار مناسب نباشد نتايج اشتباه بدست مي آيد.

نگهداري غلط ديسك ها و استفاده از محيط هاي كشت تاريخ گذشته موجب خطا مي شود.

بسياري از باكتريها كم كم به آنتي بيوتيك هاي مختلف مقاوم مي شوند، كه اين مي تواند عمر آنتي بيوتيكها را به سوي افول هدايت كند.

استفاده زياد از سولفوناميدها باعث بيماريهاي عصب شنوايي و يا بيماريهاي كليوي خواهد شد.

مصرف زياد پني سيلين باعث ترومبوسيتوپني و مصرف زياد تتراسايكلين موجب گرانولوسيتوپني مي شود.

ديسك ها بايد حداكثر به مدت يك ماه در يخچال و بيش از يك ماه در فريزر نگهداري شوند.

آمينوگليكوزيدها بر روي باكتريهاي بي هوازي بي هوازي بي‌تأثير هستند.

كلرامفنيكل در نمونه ادراري استفاده نمي شود، زيرا وارد مجاري ادراري نمي گردد.

تتراسايسكلين آنتي بيوتيك وسيع الطيفي است و معمولاً به صورت موضعي استفاده مي شود.