Mycobacterium tuberculosis Complex, Molecular Detection, PCR

نام اختصاری

 M.tuberculosis Complex PCR 

سایر نام ها

Acid-Fast Bacilli (AFB) PCR, Bacillus: Acid-Fast PCR, MTB (Mycobacterium tuberculosis) PCR, TB (Tuberculosis) PCR, Tubercle Bacilli: Mycobacterium tuberculosis PCR

نوع نمونه قابل اندازه گیری

مایعات بدن نظیر مایع مغزی نخاعی (CSF)، مایع مفصلی، مایع معده و مایع صفاقی، نمونه های تنفسی شامل خلط، ترشحات برونش ها و BAL (bronchoalveolar lavage fluid) ، مدفوع، بافت که می تواند به صورت تازه یا پارافین شده باشد، استخوان، مغز استخوان و یا ادرار.

حجم نمونه مورد نیاز

مایعات بدن نظیر مایع آسپیره شده از مغز استخوان، مایع نخاعی (CSF) و غیره1 ml ،

مایع حاصل از شستشوی معده ml10،

نمونه های تنفسی شامل خلط، ترشحات برونش ها و BAL، 3 ml ،

مدفوع 10 – 5 gr ، ادرار2 ml

بافت شامل بافت تازه، پارافینی، استخوان و بیوپسی استخوان 10 – 5 mm

شرایط نمونه گیری

نیاز به ناشتایی نمی باشد.

نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

برای تهیه نمونه از خلط، ابتدا باید بیمار دهانخود را با آب شستشو داده و سرفه‏های عمیق انجام دهد. خلط صبحگاهی یا خلطی که با تحریک سرم نمکی فیزیولوژیک و از طریق بخور تهیه می‏گردد برای آزمایش مناسب‏تر است. از آسپیرة معده، برونشیال یا نای نیز می‏توان به عنوان نمونه استفاده نمود.

کاربردهای بالینی

تشخیص زود هنگام و به موقع مبتلایان  به عفونت سل، جهت انجام اقدامات درمانی مناسب و مدیریت بیماری و جلوگیری از عوارض ناشی از آن.

اطلاعات تکمیلی

سل یکی از مهم ترین بیماری های عفونی در سراسر جهان است که در اثر آلودگی با باکتریهای گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایجاد می شود. حدود 2 میلیارد نفر یعنی تقریباً یک سوم جمعیت جهان به این باکتری آلوده اند. هر ساله نزدیک به 9 میلیون نفر به سل مبتلا می شوند و در حدود 2 میلیون نفر در نتیجه ابتلاء به این بیماری می میرند.

مایکوباکتریوم ها، باکتری های میله ای شکل هوازی هستند و اسپور تشکیل نمی دهند. اگرچه این باکتریها به سهولت رنگ آمیزی نمی شوند، اما بعد از رنگ آمیزی، حذف رنگ توسط اسید یا الکل مشکل است از این رو، آنها را باسیل های اسیدفست (مقاوم در برابر اسید) می نامند. مایکوباکتریوم ها هوازی اجباری بوده و انرژی مورد نیاز خود را از اکسیداسیون مواد کربن دار ساده به دست می آورند. زمان رشد این باکتری ها بسیار آهسته تر از سایر باکتریها است.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می تواند از طریق تنفسی از فرد آلوده به فرد سالم منتقل شود و اگر افراد آلوده به موقع شناسایی نشده و تحت درمان ضد باکتریایی صحیح قرار نگیرند، باکتری پتانسیل بالایی جهت مقاوم شدن به آنتی بیوتیک ها دارد. لذا تشخیص سریع و دقیق سل در بیماران از اهمیت بالایی برخوردار است.

روش مرجع

 کشت باکتری

روش ارجح

ردیابی ژنوم باکتری به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از تکنیک Real Time PCR

سایر روشها

 رادیوگرافی ریه، اسمیر و کشت خلط، تست توبرکولین، تست های سرولوژیکی و روشهای مولکولی.

مقادیر طبیعی

 DNA باکتری توبرکلوز در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.

محدوده قابل سنجش

حساسیت تشخیص تست، یک کپی در میکرولیتر می باشد یعنی در 95 درصد مواردی که تیتر مایکوباکتریوم در نمونه مورد آزمایش بیشتر از این میزان باشد، تشخیص داده خواهد شد.

تفسیر

هم چنان که پیشتر ذکر شد، سل یکی از بیماری های عفونی بالقوه کشنده است و شیوع آن در سراسر جهان، خطر جدی برای زندگی بشر محسوب می شود. در تشخیص عفونت سل عوامل متعددی نظیر اپیدمیولوژی بیماری در منطقه، تاریخچه بیمار، علائم بالینی، رادیوگرافی ریه، اسمیر و کشت خلط، تست های پوستی، آزمایشات بیوشیمیایی و روشهای مولکولی نظیر PCR اهمیت دارند ولیکن سرعت و دقت در تشخیص بیماری یکی از مسائل جدی محسوب می شود. روش رنگ آمیزی مستقیم از دقت و حساسیت پایینی برخوردار است و کشت خلط بسیار زمان بر است. بنابراین استفاده از روشی آسان و حساس، به عنوان مکمل و در جهت تأیید تشخیص بالینی لازم و ضروری است. از این رو روش Real time PCR، به عنوان روشی مؤثر و سریع جهت تشخیص به موقع و انجام اقدامات درمانی مناسب مورد توجه می باشد.

ردیابی پاتوژن به وسیله Real time PCR، بر اساس تکثیر نواحی اختصاصی از ژنوم باکتری صورت می گیرد. در این روش محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود که این امر عموماً  به واسطه پروب های الیگونوکلئوتیدی که به طور اختصاصی به محصول تکثیر یافته متصل می شوند، صورت می گیرد. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR (یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، محصول جمع شده را ردیابی نموده و کمیت آن را نیز تعیین نمائیم.

عوامل مداخله گر

هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.

نمونه گیری در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات

نتیجه «Undetected» نشان می دهد که DNA باکتری در نمونه یافت نشده است.

نتایج کمی بیان شده به واحد copy/ml نشان دهنده میزان فعالیت باکتری و تکثیر آن در بیمار است.

نتایج کمی بر پیشرفت بیماری و یا پاسخ به درمان ضد باکتریایی نظارت می کند.

تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA ی باکتری در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.

در صورت عدم ردیابی DNA پاتوژن در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به عفونت باکتریایی رد نمی گردد چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسیدنوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته ‌باشد.